Temat: Zα - Prolib Integro

Skocz do pozycji: 1.

Tytuł:: The left-handed double helical nucleic acids.
Autorzy:: Brown, Bernard
Rich, Alexander
Tematy:: Zα
Z-RNA
Z-DNA
RNA editing
hypermutation
ADAR1; Pokaż więcej
Wydawca:: Polskie Towarzystwo Biochemiczne
Powiązania:: https://bibliotekanauki.pl/articles/1044114.pdf Link otwiera się w nowym oknie
Opis:: The conversion of right-handed dsDNA and dsRNA to the left-handed Z-conformation involves a reorganization of the nucleotides relative to each other. This conversion can be facilitated by the tight binding of a Z-conformation-specific protein domain from the editing enzyme dsRNA adenosine deaminase. This may influence the modification of both pre-mRNAs as well as some replicating RNA viruses.
Dostawca treści:: Biblioteka Nauki

Artykuł

na półce

Skocz do pozycji: 2.

Tytuł:: the study of binding DL76 with acid alpha1-glycoprotein
Badanie wiązania preparatu DL76 z kwaśną α-glikoproteiną
Autorzy:: Jaracz, Anna
Opis:: The purpose of this work was to determine binding compound DL76 with an acid α1 glycoprotein. DL76 is non- imidazole histamine H3 receptor antagonist. Receptor H3 is located in CSN and its activation modulates the release of histamine and other important neurotransmitters as well. It is suggested that DL76 may play important role in treatment of neurological disorders such as: schizophrenia, depression or epilepsy. In this study Fast Micro Equilibrium Dialysis was used. This method employs a dialysis cell which contains 2 reservoirs separated by a semipermeable dialysis membrane. Protein and compound solution is placed in one reservoir while buffer is located in the other. The system should be incubated at physiological temperature (37 ) and allowed to reach equilibrium. After reaching equilibrium, the fluid from reservoir without protein was removed and analysed with specific liquid chromatography electrospray ionization- tandem mass spectrometry method for drug concentration. Binding acid α1 glycoprotein with DL76 was about 75% and the higher total concentration the lower binding percent. Analysis of non linear regression determined one class of protein binding sites, with n= 9,4. Association constant (Ka) was 1,498 • 104 M-1, and dissociation constant (Kd) was 66,77 μM. Bounding capacity determined as was 1,399 • 105 M-1.
Celem pracy było określenie stopnia wiązania substancji DL76 z kwaśną α1 glikoproteiną. Ocena wiązania leku z białkiem dotyczyła preparatu DL76 będącego pochodną 3 piperydynopropan-1-olu. Związek ten jest antagonistą receptora H3 histaminowego, który jest głownie zlokalizowany z centralnym systemie nerwowym. W związku z powyższym dopatruje się jego potencjalnej roli w leczeniu chorób neurologicznych takich jak: depresja, padaczka czy schizofrenia.W badaniu zastosowano metodę dializy równowagowej typu Fast Micro Equilibrium Dialysis. Jest to metoda referencyjna, łatwa w wykonaniu oraz stosunkowo szybka. Eksperyment przeprowadza się przy pomocy naczynka dializacyjnego składającego się z dwóch komór oddzielonych od siebie błoną dializacyjną o wartości odcięcia równej 10000 Da. W jednej z komór umieszcza się roztwór buforu fosforanowego (PBS) o pH=7,4; a w drugiej roztwór białka oraz DL76 o odpowiednim stężeniu. Cząsteczki związku wiążą się z białkiem, a reszta dyfunduje prze błonę półprzepuszczalna i po pewnym czasie ustala się równowaga stężeń wolnego leku po obu stronach membrany. Naczynko inkubuje się w temperaturze 37 przez czas potrzebny do ustalenia tego stanu. W przypadku badania wiązania DL76 z kwaśna α1- glikoproteina czas ten wyniósł 3 godziny. Następnie, z komory gdzie znajduje się bufor z lekiem, pobiega się próbkę i analizuje ją odpowiednio czułą metodą analityczną. W tej pracy wykorzystano metodę LC/MS/MS. Analiza wyników pozwoliła określić stopień wiązania DL76 z białkiem wynoszący ok. 75%. Na podstawie zależności ułamka frakcji związanej do stężenia całkowitego związku wyciągnięto wniosek, iż wraz ze wzrostem stężenia całkowitego maleje procent wiązania DL76 z kwaśną α1 glikoproteiną. Dzięki zastosowaniu metody regresji nieliniowej wykazano najlepsze dopasowanie dla modelu jednej klasy miejsc wiążących o n równym 9,4. Stała asocjacji (Ka) wynosi 1.498 • 104 M-1, a stała dysocjacji (Kd) będąca jej odwrotnością wynosi 66.77 μM. Pojemność wiązania obliczona jako iloczyn wynosi 1,399 • 105 M-1.
Dostawca treści:: Repozytorium Uniwersytetu Jagiellońskiego

Inne

na półce

Skocz do pozycji: 3.

Tytuł:: Badanie specyficzności oddziaływania N-końcowej helisy podjednostki α heterotrimerycznego białka G z lipidami
Studies on the specificity of interaction of N-terminal helix of heterotrimeric G protein alpha subunit with lipids
Autorzy:: Borkowska, Paulina
Opis:: Heterotrimeryczne białka G należą do białek podbłonowych, składają się z podjednostek α, β i γ i biorą udział w przekazie sygnału razem z receptorami sprzężonymi z białkami G (ang. GPCRs). Interakcja z błoną heterotrimerycznych białek G pełni ważną funkcję w przekazie sygnału. Do najważniejszych miejsc wiązania z błoną podjednostek Gα należy N-końcowa helisa. Za oddziaływanie odpowiadają kotwice lipidowe: mirystylacja lub palmitynacja oraz dodatnio naładowane reszty aminokwasowe. Nie jest poznane, w jaki sposób te elementy odpowiadają za specyficzne oddziaływanie z lipidami poszczególnych podjednostek Gα.Celem niniejszej pracy było zbadanie N-końcowej helisy podjednostki Gαs, nie posiadającej kotwic lipidowych. W tym celu oczyszczono i zbadano chimerę składającą się z N-końcowej helisy podjednostki Gαs związanej z mGFP. W szczególności celem było poznanie struktury drugorzędowej chimery i zmian w strukturze drugorzędowej pod wpływem: 2,2,2-trifluoroetanolu TFE (substancji naśladującej błonę komórkową) oraz składu buforu. Wykonano także badania stabilności termicznej w porównaniu do mGFP za pomocą skaningowej kalorymetrii różnicowej. Wykonano wstępną analizę wiązania chimery do wybranych lipidów za pomocą metody dot blot. Wykazano, że N-końcowy fragment Gαs-GFP przyjmuję strukturę α-helisy. W przeprowadzonych badaniach TFE nie indukowało powstania α-helisy zarówno w mGFP jak i w Gαs-GFP, skład buforu nie miał wpływu na zawartość procentową α-helisy w chimerze. Wykazano, że N-końcowa helisa jest niestabilna termicznie i nie ma wpływu na zwijanie białka mGFP. Wstępne wyniki pokazały, że chimera może specyficznie oddziaływać z lipidami. Białko preferencyjnie wiąże się do tratw lipidowych oraz ujemnie naładowanych lipidów w mieszaninie POPC/POPS.
Heterotrimeric G proteins belong to peripheral proteins, consist of α, β and γ subunits and are part of the signaling pathway with G protein-coupled receptors (GPCRs). The interaction with the inner side of membrane has a pivotal function in the signal transduction. The most important membrane binding part of Gα subunits is N-terminal helix, which are anchored to the membrane by palmitoylation or myristylation. Positively charged structural motif in N-termini is second important signal for binding protein to the membrane. It is unknown how these elements are responsible for specific interaction of different Gα subunits with lipids.The aim of this study was to examine the N-terminal helix of Gαs subunit, without lipid anchors. In order to achieve this, the chimera consisting of N-terminal helix Gαs subunit fusioned with mGFP was used. Gαs-GFP was purified and examined. In particular, the aims of this study were examination of the chimera’s secondary structure and impact of: 2,2,2-trifluoroethanol (membrane mimetic and solvent), composition of buffer solution. The thermal stability of chimera compared to mGFP were also examined by differential scanning calorimetry (DSC). The preliminary analysis of the chimera binding to selected lipids was performed by dot blot method.The study has shown that the N-temini of Gαs-GFP adopts a α-helix structure. It was shown that TFE didn’t induce helix formation in mGFP and Gαs-GFP, composition of buffer solution had no effect on the α-helix content in the chimera protein. Preliminary results demonstrated that the chimera might specifically bind to lipid rafts and negatively charged POPC/POPS mixture.
Dostawca treści:: Repozytorium Uniwersytetu Jagiellońskiego

Inne

na półce

Skocz do pozycji: 4.

Tytuł:: Production and cell localization research of recombinant trimeric G proteins GαoA and GαoB
Produkcja oraz badania lokalizacji komórkowej rekombinowanych trimerycznych białek GαoA oraz GαoB
Autorzy:: Szyszko, Dominika
Opis:: Mechanizm oddziaływań heterotrimeryczych białek G oraz sprzężonych z nimi receptorów GPCR stanowi niezwykle ważną część procesu przekazu sygnału w żywych komórkach. Obecność wysokich stężeń białek Gαo w mózgu człowieka wskazuje na pełnienie przez nie istotnej roli w jego funkcjonowaniu. Niniejsza praca magisterska dotyczy otrzymania znakowanych fluorescencyjnie dwóch izoform białek Gαo oraz badań ich lokalizacji komórkowej. W celu uzyskania konstruktów genetycznych białek GαoA oraz GαoB połączonych z sekwencjami białek fluorescencyjnych mCitrine, mCherry oraz mEGFP wykorzystano metodę OE PCR Cloning. Zastosowanym modelem komórkowym była linia HEK 293. Badania lokalizacji komórkowej przeprowadzono z użyciem technik mikroskopii konfokalnej w postaci obrazowania oraz fluorescencyjnego rezonansowego transferu energii. Do pomiarów czasów życia fluorescencji oraz obliczenia wydajności transferu energii wykorzystano parę donor-akceptor w postaci białek Gαo mCitrine oraz receptora dopaminowego D2-mCherry. Uzyskane wyniki wskazują na osiągnięcie pełnej funkcjonalności przez otrzymane białka fuzyjne oraz na wspólną lokalizację białka GαoA wraz z receptorem dopaminowym D2 w błonie komórkowej.
The mechanism of action of heterotrimeric G-proteins and their coupled receptors is extremely important in the process of signal transduction in living cells. High concentrations of Gαo proteins in human brain indicate their crucial role in brain function. This project focuses on production of two distinct isoforms of Gαo proteins with fluorescent tags and their localization in cells. In order to obtain DNA constructs of GαoA and GαoB with sequences of fluorescent proteins mCitrine, mCherry and mEGFP an OE PCR Cloning method was used. HEK 293 cell line was applied as a cell model. The research of subcellular localization was carried out with confocal microscopy methods as fluorescent imaging and fluorescence resonance energy transfer. For fluorescent lifetimes and the energy transfer efficacy measurements the Gαo-mCitrine was used as an energy donor and the dopamine receptor D2-mCherry as an energy acceptor. The results indicate obtaining correct functional activity of all designed fusion proteins and the co-localization of GαoA with dopamine receptor D2 in cell membrane.
Dostawca treści:: Repozytorium Uniwersytetu Jagiellońskiego

Inne

na półce

Skocz do pozycji: 5.

Tytuł:: Przygotowanie funkcjonalnych konstruktów genetycznych podjednostki αi1 białka G z białkami fluorescencyjnymi: mGFP, Citrine oraz mCherry
Preparation a functional genetic construct of G-protein αi1 subunit and fluorescent protein: mGFP, Citrine and mCherry
Autorzy:: Kluz, Marta
Opis:: GPCRs (G Protein-Coupled Receptors) are one of the most diverse group of transmembrane receptors presented in living cells. Binding of a specific ligand cause conformational changes and activate the receptor to interact with G proteins. Trimeric G proteins contain α, β and γ subunits. The result of activation of GPCR is replacement GDP into GTP bound to the α subunit and dissociation of complex into activated α subunit and βγ dimer which are engaged in various intracellular signal pathways. The main goal of this project was preparing functional genetic construct of Gαi1 subunit and fluorescent protein: mGFP, Citrine and mCherry. Creating a fluorescent fusion protein withGαi1 subunit allow to analyze G protein plasma membrane localization and study of G protein- dependent mechanisms of signal transduction.
Receptory sprzężone z białkami G (G Protein-Coupled Receptor) stanowią jedną z najbardziej różnorodnych grup receptorów transbłonowych. Poprzez związanie ze specyficznym ligandem receptor ulega aktywacji i oddziałuje z ulokowanym w wewnętrznej części błony trimerycznym białkiem G, zbudowanym z podjednostek α, β i γ, będącym swoistym „przełącznikiem molekularnym” o aktywności GTPazy. Celem pracy było otrzymanie konstruktów podjednostki Gαi1 z białkami fluorescencyjnymi: mGFP, Citrine oraz mCherry. Stworzenie białka fuzyjnego podjednostki αi1 białka G o funkcji inhibitorowej z białkiem fluorescencyjnym pozwoli na analizę jego lokalizacji w błonie oraz umożliwi poznanie mechanizmu przekazywania wewnątrzkomórkowych sygnałów za pośrednictwem białek G.
Dostawca treści:: Repozytorium Uniwersytetu Jagiellońskiego

Inne

na półce

Skocz do pozycji: 6.

Tytuł:: Studies on the interactions of the human, lipid anchor-deprived Gαi1 subunit of heterotrimeric G protein with lipids, obtained in bacterial expression system
Badania oddziaływania pozbawionej modyfikacji lipidowych ludzkiej podjednostki Gαi1 heterotrymerycznego białka G z lipidami, wyprodukowanej w bakteryjnym systemie ekspresyjnym
Autorzy:: Smok, Izabela
Opis:: G protein-coupled receptors (GPCRs) comprise one of the largest membrane protein groups, involved in signal transduction across cell membranes through heterotrimeric G proteins. G proteins are composed of Gα and heterodimeric complex Gβγ subunits. As a peripheral membrane protein, Gα subunit interacts with the inner leaflet of the plasma membrane through covalently attached myristate and/or palmitate fatty acids anchors. Recently, the role of positively charged patch in the N-termini helix has been highlighted in potential Gα subunit – membrane interactions, which facilitate G protein activation, regulation and effector protein binding. Nevertheless, the significance of amino acid sequence and its impact on cell membrane interaction remains unclear.The aim of this study was to examine possible interaction patterns of human, anchor-deprived, heterotrimeric G protein Gαi1 subunit with selected lipid mixtures in the form of MLV liposomes, as a membrane mimetic. In order to achieve this goal, protein subunit has been overexpressed in bacterial system and subsequently purified. Additionally, several physicochemical parameters have been established, such as enzymatic activity of GTPase domain, secondary structure contents quantification (circular dichroism, CD), thermostability (CD), as well as the stability and the determination of protein aggregation tendency (dynamic light scattering, DLS). As a result, samples containing monomeric, properly folded and enzymatically active Gαi1 subunit have been obtained. Protein subunit has shown a slight interaction preference with short-chain and unsaturated lipids whilst low binding to lipids enriching membrane domains. Presented data may be useful for further, more detailed studies on Gαi1 subunit – cell membrane interactions.
Receptory sprzężone z białkami G (GPCRs) należą do jednej z najliczniejszych grup białek błonowych, odpowiedzialnych za przekaz sygnału komórkowego. Propagacja sygnału od GPCRs w głąb komórki zależna jest od przybłonowych białek partnerskich, heterotrymerycznych białek G, utworzonych ze składowych: Gα i heterodimeru Gβγ. Podjednostka Gα posiada zdolność oddziaływania z błoną komórkową poprzez modyfikacje lipidowe (palmitoilacja i/lub mirystylacja). Postuluje się również interakcję białka z dwuwarstwą na bazie sekwencji aminokwasowej, szczególnie N-końcowej helisy, bogatej w aminokwasy naładowane dodatnio. Oddziaływanie z błoną jest istotne nie tylko w kontekście samego przekazu sygnału od receptorów, ale także dla aktywacji, regulacji aktywności oraz interakcji z białkami efektowymi. W tym aspekcie rola sekwencji aminokwasowej oraz powinowactwo Gα do danych typów lipidów są wciąż słabo scharakteryzowane. Celem niniejszej pracy była analiza możliwości potencjalnego oddziaływania ludzkiej podjednostki Gαi1 heterotrymerycznego białka G, pozbawionej modyfikacji lipidowych, z wybranymi mieszaninami lipidowymi w postaci liposomów MLV, jako modelem dwuwarstwy lipidowej. W tym celu dokonano nadprodukcji białka w systemie bakteryjnym oraz oczyszczania. Wstępnie określono niektóre parametry Gαi1, jak aktywność enzymatyczną domeny GTPazowej, oszacowano zawartość struktur II-rzędowych (dichroizm kołowy, CD), termostabilność (CD) oraz określono stabilność i tendencję białka do agregacji (dynamiczne rozpraszanie światła, DLS).Otrzymano monomeryczną, poprawnie sfałdowaną, aktywną enzymatycznie podjednostkę Gαi1, cechującą się preferencją oddziaływania z lipidami o krótkich i nienasyconych łańcuchach wodorowęglanowych, przy jednoczesnym słabym powinowactwie do lipidów charakterystycznych dla domen błonowych. Przedstawione badania mogą służyć jak punkt wyjścia do dokładniejszej analizy interakcji podjednostki Gαi1 z błoną komórkową.
Dostawca treści:: Repozytorium Uniwersytetu Jagiellońskiego

Inne

na półce

Skocz do pozycji: 7.

Tytuł:: Badania stabilności i oddziaływania z lipidami podjednostki Gαi2 ludzkich białek G otrzymywanej w Escherichia coli
Studies on the stability and interaction with lipids of the Gαi2 subunit of human G proteins obtained in Escherichia coli
Autorzy:: Oliwa, Wiktoria
Opis:: Heterotrimeric human G proteins are composed of three subunits: Gα, Gβ and Gγ. They are one of the main partners for G protein-coupled membrane receptors (GPCRs). These receptors play an important role in signal transduction, which determines, for example, the maintenance of homeostasis or the regulation of the immune and nervous systems. They also play an important role in tumorigenesis, making them an important therapeutic target. The close association of these receptors with G proteins determines their functional relevance in the cell. GPCR receptors are transmembrane proteins, and G proteins themselves interact closely with the cell membrane. This is made possible by lipid modifications of the Gα and Gγ subunits, as well as the presence of regions of the protein that directly interact with the membrane. In this study, we investigated the effect of the structure of the Gαi2 subunit on tendency of the protein to associate with selected lipid groups. Screening tests of the binding of this subunit without the presence of lipid modifications to liposomes of different lipid compositions showed the tendency of its interaction with selected negatively charged lipids, lipids having a phosphoethanolamine head and characteristic of so-called "lipid rafts". In addition, the effects of environmental pH conditions and the presence of GDP on the structural and thermal stability of the protein were studied. They showed an increase in the stability of the Gαi2 subunit in the presence GDP and under pH conditions close to 7.0. The protein was produced in a modified bacterial expression system of Escherichia coli. It showed the advantage of producing this protein under reduced temperature conditions (27°C) for 4 hours to obtain the most efficient possible expression of correctly folded, soluble protein.
Heterotrimeryczne ludzkie białka G zbudowane są z trzech podjednostek: Gα, Gβ oraz Gγ. Stanowią one jeden z głównych partnerów dla receptorów błonowych sprzężonych z białkami G (GPCR). Receptory te odgrywają istotną rolę w przekazie sygnału, który determinuje przykładowo zachowanie homeostazy czy regulację układu immunologicznego i nerwowego. Odgrywają one również istotną rolę w nowotworzeniu, przez co stanowią istotny cel terapeutyczny. Ścisłe powiązanie tych receptorów z białkami G determinuje ich funkcjonalną istotność w komórce. Receptory GPCR są białkami transbłonowymi, a same białka G ściśle oddziałują z błoną komórkową. Jest to możliwe dzięki modyfikacjom lipidowym podjednostek Gα oraz Gγ, a także obecności regionów białka bezpośrednio oddziałującymi z błoną. W pracy zbadano wpływ struktury podjednostki Gαi2 na tendencje do asocjacji białka do wybranych grup lipidów. Badania przesiewowe wiązania tej podjednostki bez obecności modyfikacji lipidowych do liposomów o różnych składach lipidowych wykazały tendencję jej oddziaływania z wybranymi lipidami ujemnie naładowanymi, lipidami posiadającymi fosfoetanoloaminową głowę oraz charakterystycznymi dla tzw. „tratw lipidowych”. Dodatkowo zbadano wpływ warunków pH środowiska oraz obecności GDP na strukturalną oraz termiczną stabilność białka. Wykazały one wzrost stabilności podjednostki Gαi2 w obecności GDP oraz w warunkach pH bliskiego 7,0. Białko produkowano w modyfikowanym bakteryjnym systemie ekspresji Escherichia coli. Wykazał on przewagę produkcji tego białka w warunkach obniżonej temperatury (27°C) przez 4 godziny celem uzyskania możliwe najbardziej wydajnej ekspresji poprawnie sfałdowanego, rozpuszczalnego białka.
Dostawca treści:: Repozytorium Uniwersytetu Jagiellońskiego

Inne

na półce

Skocz do pozycji: 8.

Tytuł:: Analiza oddziaływania receptora dopaminowego D2 z podjednostką Gαi1 trimerycznego białka G metodą obrazowania czasów życia fluorescencji FLIM – FRET
Analysis of dopamine D2 receptor and Gαi1 subunit interaction using fluorescence lifetime imaging microscopy FLIM – FRET
Autorzy:: Kluz, Marta
Opis:: GPCRs (G Protein-Coupled Receptors) are the largest group of transmembrane receptors presented in eukaryotic cells. One of the most important class belong to GPCRs are dopamine receptors in central nervous system which play significant role as treatment targets in neurodegenerative diseases. Specific ligands bind and activate receptors which undergo conformational changes and they are enable to interact and activate trimeric G – proteins anchored to the plasma membrane and responsible for regulation diverse cellular pathways. Förster resonance energy transfer (FRET) is a useful tool to analyze protein – protein interactions in living cells. Improvement of molecular techniques give us an opportunity to create fusion proteins with fluorescent proteins and do in vitro researches. The main aim of this project was analyzing of dopamine D2 receptor and Gαi1 subunit interaction using FRET detected by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). There were performed measurements before and after receptor stimulation. Analyze of this interaction allows to study of G – protein dependent mechanism of signal transduction to find new therapeutic alternatives for neurodegenerative diseases treatment.
Receptory sprzężone z białkami G – GPCR stanowią najliczniejszą grupę receptorów błonowych. Należą do nich m. in. receptory dopaminowe, które są istotnym celem działania leków przeciwpsychotycznych. W wyniku związania liganda oddziałują z zakotwiczonymi w błonie trimerycznymi białkami G, prowadząc do regulacji działania szeregu mediatorów odpowiedzi komórkowej. Jedną z metod badania oddziaływania białko – białko jest analiza Försterowskiego rezonansowego transferu energii. Rozwój genetyki molekularnej umożliwił tworzenie białek fuzyjnych ze znacznikami w postaci białek fluorescencyjnych i prowadzenie badań w układach in vitro. Celem pracy było zbadanie oddziaływania receptora dopaminowego D2 z podjednostką Gαi1 trimerycznego białka G metodą obrazowania czasów życia fluorescencji FLIM – FRET. Wykonano pomiary bez stymulacji oraz ze stymulacją receptora agonistami. Analiza ich oddziaływania otwiera drogę do lepszego poznania mechanizmu przekazu sygnału za pośrednictwem białek G, odnalezienia nowych związków o potencjale terapeutycznym i opracowania skuteczniejszych leków w walce z chorobami neurodegeneracyjnymi.
Dostawca treści:: Repozytorium Uniwersytetu Jagiellońskiego

Inne

na półce

Skocz do pozycji: 9.

Tytuł:: Wpływ pochodnych itakonianu na wydzielanie białka SLPI (wydzielniczego inhibitora proteaz leukocytarnych) przez aktywowane makrofagi
Influence of itaconate derivatives on the secretion of SLPI (secretory leukocyte protease inhibitor) by activated macrophages
Autorzy:: Czechowska, Iga
Opis:: Makrofagi po rozpoznaniu patogenów lub PAMP (wzorców molekularnych związanych z patogenami) wydzielają białko SLPI (wydzielniczy inhibitor proteaz leukocytarnych). W niniejszej pracy wykorzystano mysie makrofagi różnicowane ze szpiku kostnego w celu zbadania możliwości zastosowania 4-oktylo itakonianu (4-OI) do regulowania wydzielania SLPI. 4-OI w aktywowanych makrofagach ograniczył wydzielanie IL-6 i zwiększył wydzielanie SLPI. Makrofagi traktowane 4-OI przed stymulacją lipopolisacharydem (LPS) wydzielały mniejsze ilości IL-6, TNF-α i większe ilości SLPI niż komórki traktowane 4-OI po stymulacji LPS. Otrzymane wyniki wskazują na potencjalne zastosowanie 4-OI w modulowaniu wydzielania SLPI przez makrofagi w schorzeniach o podłożu zapalnym.
Macrophages secrete SLPI (secretory leukocyte protease inhibitor) following pathogen or PAMP (pathogen-associated molecular patterns) recognition. In this study, murine bone marrow-derived macrophages were utilized to investigate the potential of 4-octyl itaconate (4-OI) in regulating the secretion of SLPI. 4-OI reduced IL-6 secretion and increased SLPI secretion in activated macrophages. Macrophages treated with 4-OI prior to lipopolysaccharide (LPS) stimulation secreted lower amounts of IL-6, TNF-α and higher levels of SLPI compared to cells treated with 4-OI after LPS stimulation. The obtained results indicate the potential use of 4-OI in modulating the secretion of SLPI by macrophages in inflammatory conditions.
Dostawca treści:: Repozytorium Uniwersytetu Jagiellońskiego

Inne

na półce

Skocz do pozycji: 10.

Tytuł:: Wpływ detergentów na efektywność solubilizacji i oczyszczanie frakcji błonowej białka G hamującego cyklazę adenylanową
Effects of detergents on adenylyl cyclase inhibitory G proteins solubilization and isolation from plasma membrane
Autorzy:: Czelakowski, Grzegorz
Opis:: W błonach komórkowych znajdują się kompartmenty o różnej stabilności i rozmiarze, będące środowiskiem faworyzującym lokalizację określonych cząstek hydrofobowych oraz wykazujących do nich powinowactwo białek integralnych i podbłonowych, wśród nich lipidowanych białek G. W szlakach sygnalizacji zależnych od receptorów GPCR jednym z kluczowych przełączników jest badane białko G hamujące cyklazę adenylanową. Wśród funkcjonujących u człowieka podjednostek występujących w różnych tkankach wybrano heterotrimer związany z układem nerwowym: Gαi3 Gβ1 Gγ2. Badane Gαi3 z kotwicą N-mirystylową i S-palimitylową podlega oddziaływaniom lokalizującym do obszarów błon wzbogaconych w nasycone kwasy tłuszczowe, sfingolipidy oraz cholesterol. Tworząca dimer Gβ1γ2 podjednostka Gγ2 jest prenylowana łańcuchem S-geranylogeranylu, przez co preferuje fazy nieuporządkowane związane z wielonienasyconymi kwasami tłuszczowymi. W pracy przedstawiono efektywność solubilizacji białek z użyciem detergentów, którą porównano z rozkładem średnic hydrodynamicznych w różnych układach micelarnych. Aby proces solubilizacji błon komórek Hi5 był skuteczny, wymagane było spełnienie szeregu warunków, poczynając od homogenizacji osadu po spełnienie różnych preferencji rozpuszczalności dla Gαi3 i Gβ1γ2. Sprawdzono wydajność różnych metod izolacji białek w tym wpływ kombinacji surfaktantów i innych składników na oddziaływania białek z lipidami. Zbadano wpływ zubożenia cholesterolu w błonach i suplementacji jego estru z kwasem bursztynowym na efekty izolacji podjednostek G. Zmiennymi czynnikami fizycznymi były metody rozdrabniania błon, temperatura i czas. Zaobserwowano, że dla wydajnej izolacji białka G korzystne było wstępne oczyszczanie błon w buforach zawierających glukozyd kokosowy lub metylo-β-cyklodekstrynę. Najlepsze efekty sekwencyjnej solubilizacji osiągano z detergentem fosfocholinowym (Fos-Cholina-12) i hemibursztynianem cholesterylu. Otrzymane wyniki wskazują, że do detergentu należy też dopasować energię ultradźwięków, temperaturę i czas homogenizacji. Wydajność izolacji białka potwierdzano specyficznymi przeciwciałami w metodzie western blot. Wyniki porównano z rozmiarami miceli określonymi przy zastosowaniu dynamicznego rozpraszania światła oraz z wartościami z literatury przedmiotu. Wyniki badań dotyczyły błon komórek owadzich, dlatego omówiono też powinowactwo białek G do lipidów w komórkach ludzkich. Przeanalizowano możliwość uszkadzania lipidowanych białek G in vitro oraz in vivo oraz zaproponowano dalsze badania w modelach fizjologicznych i patologicznych.
Investigated heterotrimeric G protein is composed of Gαi3, Gβ1, and Gγ2 subunits, which are found especially within nervous tissues. They take part in signal transduction from G protein-coupled receptors, causing inhibition of adenylyl cyclase, while being dynamically regulated by their environment. Cellular membrane domains are various complexes of lipids with specific integral and peripheral proteins. They may be instrumental in organizing cellular functions and involve G proteins posttranslationally modified with hydrocarbon chains, a pivotal membrane-bound protein. This heterotrimer processing involves S-palmitoylation and N-myristoylation of Gαi3, also geranylgeranylation of Gγ2. Membrane localization is governed by these lipid anchors, and interactions are changed on the molecular level, with saturated fatty acids, sphingolipids, cholesterol, etc.This research focused on the efficacy of protein solubilization and isolation from plasma membranes biosynthesized in Hi5 insect cells. These processes depended on physico-chemical interactions studied in vitro, and conclusions were correlated with extensive in vivo literature research. Physical factors were adjusted with different incubation temperatures, homogenization rigour, ultrasonic energy, etc. In these experiments conditions were checked agains a large set of buffers, combining many types of surfactants.The most efficient G protein isolation was done after membranes pre-purification in buffers containing coco-glucosides or methyl-β-cyclodextrin. The subsequent solubilization was done with Fos-Choline-12 and cholesteryl hemisuccinate. Delivering higher-power ultrasonic energy had its benefits and drawbacks, but results highly depended on detergents. Protein isolation efficacy was confirmed with specific antibodies with the western blot method. The results were compared with micelle size distributions determined using dynamic light scattering and compared to literature. Obtained results concerned insect cells membranes, therefore affinity of G proteins to human membrane domains was also discussed. The possibility of damaging lipidated G proteins in vitro and in vivo was analysed, and further studies in physiological and pathological models were proposed.
Dostawca treści:: Repozytorium Uniwersytetu Jagiellońskiego

Inne

na półce

Informacja

Wyszukujesz frazę "Zα" wg kryterium: Temat