- Tytuł:
-
Designing a system for evaluation of chemerin antimicrobial properties
Opracowanie układu do badania antybakteryjnych właściwości chemeryny - Autorzy:
- Nowak, Mikołaj
- Opis:
-
Chemerin is a small multifunctional protein. It is involved in various processes ranging from a chemotaxis of immune cells to adipogenesis and regulation of metabolism. Chemerin also exhibits a potent antimicrobial activity and was proved to inhibit growth of both bacteria and fungi.The aim of this work was to design a system for evaluation of antimicrobial activity of chemerin and to study its putative involvement in changes of skin microbiome, which are observed in psoriasis. Psoriasis is a common autoinflammatory disease, in which significant alterations of both chemerin expression and bacterial populations in skin take place. Moreover, bacteria were shown to regulate chemerin activity by a proteolytic cleavage. A skin pathogen, Staphylococcus aureus secrets staphopain B, a protease converting inactive prochemerin to a highly chemotactively active chemerin isoform, thus affecting a recruitment of immune cells to inflammatory sites.In order to create a system for studying chemerin involvement in microbiome alterations, a bioinformatical analysis of three bacterial genes (16S rRNA, sodA i rpoB) from selected strains was performed. Both primer pairs specific for every strain and compatible TaqMan probes were designed based on the alignments. Preliminary conditions of qPCR were established and used for an assessment of primer specificity. A genomic DNA isolation approach with silica columns as well as a direct lysis of bacteria in a reaction mixture were subsequently tested.Most of the primer pairs were proved to be highly selective towards specific bacterial strains. The isolation method resulted in a high correlation between number of cells and signal intensity in the samples, whilst a combined direct thermal and enzymatic lysis significantly increased PCR efficiency in the samples. This allowed us to confirm a viability of the system, which might eventually provide an insight into the role of chemerin in pathogenesis of psoriasis.
Chemeryna jest niewielkim białkiem pełniącym wiele funkcji w organizmie. Do najlepiej zbadanych należy chemotaktyczny wpływ na komórki układu odpornościowego, udział w procesie adipogenezy czy w regulacji metabolizmu. Niedawne badania potwierdziły również działanie antybakteryjne chemeryny w stosunku do wybranych gatunków bakterii i grzybów.W niniejszej pracy podjęto próbę opracowania układu pozwalającego na analizę aktywności przeciwbakteryjnej chemeryny w kontekście jej możliwego wpływu na zmianę populacji ludzkiego mikrobiomu w łuszczycy. W przebiegu tej choroby, o sugerowanym podłożu autoimmunizacyjnym, obserwuje się zaburzenia stosunków poszczególnych populacji bakterii, którym towarzyszą istotne zmiany profilu ekspresji chemeryny w skórze. Jednym z gatunków bakterii, której poziom ulega istotnym zmianom w łuszczycy, jest Staphylococcus aureus. Podczas infekcji, gatunek ten wydziela stafopainę B, proteazę posiadającą zdolność proteolitycznej konwersji nieaktywnej biologicznie prochemeryny do izoformy chemeryny o najwyższej aktywności chemotaktycznej. W celu opracowania układu do analizy zmian w obrębie wielogatunkowych konsorcjów bakterii indukowanych przez chemerynę, przeprowadzono analizę bioinformatyczną sekwencji trzech genów bakteryjnych (16S rRNA, sodA i rpoB). Uzyskane dopasowania posłużyły do zaprojektowania specyficznych gatunkowo par starterów oraz kompatybilnych z nimi sond TaqMan. Po przeprowadzeniu optymalizacji warunków reakcji qPCR, przetestowano specyficzność wykrywania poszczególnych gatunków bakterii z udziałem przygotowanych par starterów, dokonano analizy metody izolacji genomowego DNA bakterii przy użyciu kolumn krzemionkowych oraz zbadano możliwość zastosowania bezpośredniej lizy bakterii w mieszaninie reakcyjnej. Wyniki doświadczeń wykazały wysoce selektywną detekcję z udziałem większości par starterów. W wynikach qPCR widoczna była wyraźna liniowa zależność intensywności sygnału od ilości bakterii użytych do izolacji. Potwierdzono możliwość zastosowania połączonej metody lizy enzymatycznej i termicznej, poprzedzającej reakcję PCR. Umożliwiło to weryfikację i rozwinięcie głównych założeń tworzonego układu. który po zakończeniu prac pozwoli na zbadanie wpływu chemeryny na skład i liczebność populacji bakterii w złożonych kulturach mikroorganizmów, a tym samym na określenie antybakteryjnej roli chemeryny w rozwoju i przebiegu łuszczycy. - Dostawca treści:
- Repozytorium Uniwersytetu Jagiellońskiego
Inne